강연 8.  Basic principles and applications of flow cytometry 

 

비임상기술지원센터는 8컬러와 13컬러 두 가지 모델의 유세포 분석기를 보유하고 있습니다. 항체 13개 컬러 동시 염색해서 확인하는 것이 가능합니다.

 

네 가능합니다. FCS 파일을 보내주시고 요청사항 전달해주시면 서비스 가능합니다.

 

유세포 분석기를 이용한 multiplex ELISA는 beads를 이용한 방식의 ELISA 기법입니다. 이러한 키트를 제공하는 대표적인 회사는 BD, Biolegend, MiltenyiBiotec 3개 회사입니다. 세 회사 중 BD는 하나하나 직접 구성 가능합니다. 원하는 단백질을 타겟하는 ‘BD CBA Flex set’ 이라는 명칭으로 되어있는 키트를 조합해서 구성합니다.

 

 intracellular staining을 마친 샘플은 고정이 되어있는 샘플이기 때문에 장시간 보관할 수 있습니다. PBS에 풀어 냉장 상태로 빛이 닿지 않는 곳에서 샘플이 마르지 않게 밀봉해두면 수개월 보관 가능합니다.

 

세포 표면 단백질 중에는 고정을 하면 epitope이 변하여 항체가 붙지 않는 경우가 있습니다. 이는 항체의 클론별로 성능이 다릅니다.

https://www.thermofisher.com/kr/ko/home/life-science/cell-analysis/cell-analysis-learning-center/cell-analysis-resource-library/ebioscience-resources/antibody-fixation-considerations.html

해당 링크를 들어가 보시면 항체 클론별로 fixation 시 염색이 가능한지 여부를 정리해 놓은 표가 있습니다. 내가 사용하는 항체가 fixation 후에도 잘 작동하는지 미리 확인 후 진행하는 것이 좋습니다.

 

실험이 잘 되었다면 정확히 분류 가능합니다. Cell cycle 측정은 중요한 과정이 2가지 있습니다. 첫째는 샘플을 유세포 분석기로 찍을 때 Flow rate를 최대한 천천히 (초당 100세포 이하)로 찍어줍니다. 둘째는 분석 시 염색한 DNA dye의 A(Area) 채널과 W(width) 채널로 닷플롯을 그려서 singlet만 게이팅을 잘해줘야 합니다. G1과 G2는 얇은 피크로 나오는데 S는 그 사이에 넓게 분포하고 있습니다. S phase를 좀 더 정확히 보려면 따로 배지에 BrdU를 첨가하고 BrdU 항체와 DNA dye를 co-staining 해주면 BrdU positive cell은 S phase로 정확히 분류할 수 있습니다.

 

Tumor tissue에서 유세포분석을 하려면 Single cell suspension으로 만들어서 분석해야 합니다. miltenyi biotec의 tumor dissociation kit를 추천합니다만 소모품 및 장비가 필요합니다. 또한 면역세포 이외의 세포들이 많이 섞여 있기 때문에 정확한 분석을 위해 MACS sorting기법을 이용해서 CD45+ 세포만 분리하여 유세포분석을 진행하는 것이 좋습니다. 이 역시 MACS sorting을 위한 기본적인 장비들이 필요합니다.

장비 문제나 Antibody panel 조성 등의 문제로 실험에 어려움을 느끼신다면 한국비임상기술지원센터에서 상담 및 의뢰가 가능합니다.

 

           같습니다. FACS (Fluorescence Activated Cell Sorter)는 BD사의 Flow cytometry 상표입니다. BD사가 유세포분석에서 유명하다 보니 FACS가 flow cytometry의 대명사처럼

           쓰입니다.

 

신경세포는 어렵습니다. antibody labeling이 필요합니다.

Biexponential histogram에서 isotype control이 음수가 나올 수 있습니다. 굳이 양수로 나와야 하는 건 아닙니다. 이를 양수로 바꾸려면 Voltage를 높여 찍으면 되는데요 너무 높으면 염색한 샘플이 saturation 되어버립니다. ISO가 음수가 나와도 상관없고 샘플이 그래프 안에 들어오는 것이 더 중요합니다.

 

이런 경우는 정확히 어떤 세포이고 어떤 목적인지 파악해야 답변드릴 수 있겠지만, 우선 실험 특성상 live cell로 하는 것이 좋을 것으로 생각됩니다. Live cell은 항체가 Internalization 될 것 같다고 하는 걸 보니 Fc receptor를 가진 세포일 것 같은데 Phagocytosis inhibitor 조건에서 실험해보시는 걸 제시드립니다.

 

괜찮습니다.

 

네 가능합니다.

 

네 물론 가능합니다. 분석팀에 문의 부탁드립니다.

 

           Sorter는 아직 보유하고 있지 않습니다.

 

CD16, CD32는 Fc receptor들의 다른 이름입니다. FC blocker는 이들에 binding 하는 항체입니다. 이 항체가 먼저 붙어서 다른 염색용 항체들이 여기에 비특이적으로 결합하는 것을 막아줍니다.

 

Beads는 완벽하지 않아서 single staining sample을 준비하시는 것을 추천 드립니다. 세포가 너무 부족하면 single staining sample을 준비하실 때 모든 샘플을 아주 조금씩 따서 모아서 한 튜브씩만이라도 만들기를 추천 드립니다. FCS 2.0 이상 지원하는 유세포 분석기로 찍으셨을 경우 분석 소프트웨어에서 compensation을 다시 할 수 있으니 조금 조정해보시는 걸 추천해드립니다. FCS 파일 제공해주시면 저희가 서비스 가능합니다.

강연 9. RNA 약물 개발을 위한 LNP 기술

1. LNP기술은 mRNA 백신을 만드는데 필요한 기술임에 틀림이 없습니다 체내에 있는 단백질은 대체적 음전하를 띄는데 그렇다면 LNP는 대체적으로 양전하를 띄는 것인데 만일 아르기닌 리신 같은 양전하  amino acid일때 그때도 LNP을 사용하여 가능하나요?

리포좀과 같은 양이온 지질 입자와 LNP 최신 기술이 다른 것은 생리적인 환경에서는 LNP 입자는 거의 중성에 가깝습니다. 이는 이온화 가능 지질과 PEG 지질의 역할에 의한 것으로 생리적인 환경에서 거의 차지가 없습니다.  따라서 단백질의 차지에 상관없이 LNP는 약물 전달이 가능합니다.  

 

2. EN-LNP의 독성 평가는 진행 되어있는건가요?

EN-LNP를 활용한 저희 siRNA치료제 경우, Monkey 모델에서 단회, 반복 독성 평가가 수행되었습니다.

 

3. 인해스드바이오에서 보유하고 있는 LNP가 기존 Moderna, Pfizer 백신에 적용된 LNP와의 구조적, 기능적 차이점은 무엇인가요?

백신 기술에 적용된 각 사의 LNP 4가지 구성성분 중에서 이온화 가능 지질 1가지만이 모두 다릅니다.

모더나 측의 SM-102 이온화 가능 지질, Pfizer측은 ALC-0315 이온화 가능 지질을 사용하며 저희는 246C10 이온화가능지질을 사용하고 지질구조가 서로 다릅니다. 각 회사마다 특허화를 위한 독특한 지질구조를 이루고 있습니다. 하지만 기능적으로 모두 PH 변화에 의해 이온화가 되며 RNA를 안정적으로 세포 내로 전달하는 동일한 역할을 합니다.

나머지 3가지 성분은 모두 상업적으로 구매하여 공통적으로 사용합니다.

 

4. EN-LNP 적용 연구결과 발표 논문 혹시 있으신가요? 있으시면 메일로 공유 가능한가요?

EN-LNP의 246C10 이온화 가능 지질과 관련된 4개의 논문을 목록을 소개드립니다.

1. Sci. Adv. 2021; 7, Feb 26, 2020. Engineered ionizable lipid nanoparticles for targeted delivery of RNA therapeutics into different types of cells in the liver

2. Lee et al,.Biomater. Sci. 2019. Adjuvant incorporated lipid nanoparticles for enhanced mRNA-mediated cancer immunotherapy

3. Han et al., Sci. Adv. 8, 2022. In vivo delivery of CRISPR-Cas9 using lipid nanoparticles enables antithrombin gene editing for sustainable hemophilia A and B therapy

4. Jin et al., Adv. Funct. Mater 7, 2022. Engineered Lipid Nanoparticles for the Treatment of Pulmonary Fibrosis by Regulating Epithelial-Mesenchymal Transition in the Lungs

 

 다양한 핵산(siRNA, mRNA, miRNA, ringRNA, plasmid DNA, including CRISPR-Cas9 mRNA)을 EN-LNP로 제형 하여 성공적으로 평가되었습니다

 EN-LNP Engineering 통해 간 조직 및 다른 장기에 세포 특이적으로 전달할 수 있습니다. (4번 답변의 1, 2, 4번 논문 참조)

 근육주사(IM) 뿐만 아니라 정맥주사 (IV)로 투여함으로 백신 및 치료제로 개발이 가능합니다.

 

EN-LNP 원천 특허의 경우, 국내 및 미국은 특허 등록이 되었습니다. 유럽, 러시아 경우 등록결정이 되어 행정적인 절차를 기다리고 있습니다.

그 외 중국을 포함한 12개국에 대해 특허가 출원되어 심사 중에 있습니다.

또한 후속 특허 2개가 국내 및 해외에 출원되었으며 그 중 최근 1건의 특허가 최근 국내 등록되었습니다.

EN-LNP 플랫폼의 경우 차세대 LNP 개발 및 LNP engineering을 통해 유전자 치료제 및 암 백신에 확대하여 적용할 수 있습니다. 실제로 앞서 발표된 246C10 지질 관련 논문들에서 세포 및 조직 특이적으로 RNA 전달을 위한 LNP 적용이 확대되었습니다.

5번 답변을 참조하시기 바랍니다.

 

단백질의 경우 실제적으로 아직 평가해 본 적은 없지만, 단백질도 LNP로 전달이 가능합니다. 다만, 봉입률이 낮아질 것으로 예상됩니다.

 

EN-LNP 경우, 처음부터 target RNA 구조에 따른 차이점을 고려하여 지질 종류 및 조성을 RNA 별로 각각 Fix 시킨 것입니다.

 

RNA 경우 LNP에 의해 봉입되어 있기에 먼저 Triton-x 100 detergent를 이용하여 LNP를 파괴시킨 후에 RNA를 정량분석 합니다.

 

실제적으로 동물실험에서 관련 자료의 경우 RNA-LNP 단독 및 병행치료 그룹에서 PD-L1이 증가됨으로 함께 Immuno-oncology 약물 즉, PD1/PL-L1 억제제와의 병행 치료 가능성을 확인하였습니다. 동물실험에서 siRNA-LNP 약물과 Immuno-oncology 약물과의 병행치료는 수행하지 않았습니다.

 

대표적인 위 2가지 immune cytokine 들이 면역원성 평가로 활용됩니다.

특히, MCP-1은 다른 cytokine과 비교하여 면역원성 민감도가 매우 높아 가장 많이 평가되고 있습니다.

 

이미 모더나 제형의 백신 IM(근육주사) 평가에서 Increase red cell distribution width, Decrease red cell mass의 수치 변화가 보고되어 있습니다.

EN-LNP 경우도 IV 펑가에서 동일하게 Increase red cell distribution width, Decrease red cell mass 가 관찰되어 모더나 사와 clinical pathology profile 유사함을 보여줍니다.

 

LNP기술 경우, 생체 내 생리적인 조건에서 즉, 혈중에서는 중성을 나타내어 세포들에게 독성을 주지 않고 약물이 방출되지 않습니다. 하지만 세포 내로 LNP 약물이 들어가면 exosome, lysosome 을 거치면서 pH가 5~6으로 낮아지게 되며 이때 세포 내에서만 약물이 방출되게 됩니다.

 

비임상 단계에서 두경부암 외에 자궁경부암 등 HPV-관련 암에 적용하고 있습니다.

 

일반적으로 동물실험으로 2~3 mg/kg 농도로 제형을 하고 있습니다. 간을 포함한 주요장기 및 암 조직으로 전달을 형광 RNA를 이용하여 확인하였습니다만, 전달량 및 효율에 대해 정량적으로 분석하지는 않았습니다.

 

▪ BBB 투과에 대한 평가는 아직 딘행되지 않았습니다. ligand 등 관련 기술을 가진 연구진과의 공동연구 등을 통하여 개발할 수 있습니다.

 

LNP 4가지 구성 성분 중에 PEG (poly ethylene glycol) 지질이 있습니다.

PEG 지질의 중요 역할이 바로 나노입자 간의 aggregation을 줄이고 나노입자를 보호하는 역할을 합니다.

 

실험실적으로 LNP 제작 시, 거의 대부분 90% 이상의 encapsulation efficiency를 보여줍니다.

 

 

참가하여주신 분들께서 많은 Q&A 질문을 남겨주셨고, 저희가 드렸던 답변이 방문해주신 선생님에게 조금이나마 도움이 되기를 바랍니다.

천천히 읽어 보신 후 추가적인 상담 및 견적이 필요하시다면 홈페이지의 견적의뢰를 통하여 접수를 부탁드립니다.

감사합니다.

오늘도 좋은 하루 보내세요