안녕하세요 한국비임상기술지원센터 마케팅팀 입니다.

 

제7회 " 신약후보물질에 대한 분석 및 비임상 시험법 " 온라인 세미나에 많은 참여와 관심을 보여주셔서 감사드립니다.

이번 온라인 세미나의 국내연자분들의 Q&A 시간에 많은 관심과 질문을 보내주셨고

참석해 주셨던 분들에게 연자분들의 답변을 공유드리고자 합니다.

강연 5. 알츠하이머 동물 모델 선택과 약효 평가법

강연 6. 수면장애 동물 모델 확립 및 불면증 타겟 약물 및 디지털헬스 기기 유효성 평가법

강연 7. 미세투석과 신경전달물질 동시 분석에 의한 정신질환 타겟 약물의 개념증명(PoC) 연구

 

          바이오 마커는 체액(biological fluid)에서 분석하며 알츠하이머 동물 모델에서도 CSF도 가능하지만, 혈액이 가능할 경우 여러 면에서 장점이 있습니다. 분석법은 ELISA

          (multiplex)법이 주로 적용되고, 저희는 triple quadrupole liquid chromatography system에 의한 질량분석법(LC-MS/MS)를 사용하고 있습니다. Mulltiplex가 더 효율적이긴

          합니다.

 

기존 행동 평가법과 면역조직염색법에서는 individulal variation이 심하여 결과 평가에서 유의성을 보이기가 쉽지 않은 반면 바이오 마커는 시간에 따른 현저한 차이(P<0.001)를 보이고 정량적인 결과로 도출될 수 있으므로 약효 평가에 훨씬 정확하게 적용될 수 있을 것으로 기대됩니다.

 

분석 결과에서는 신뢰도가 가장 중요하여 분석법과 분석 결과가 밸리데이션이 되어야 수치를 믿을 수 있습니다. 논문으로 작성할 경우에는 일반 실험실에서 얻은 결과도 사용 가능하지만 허가를 위한 규제기관에 제출될 경우에는 검증된 기관에서 분석한 결과이거나 적어도 밸리데이션 자료는 같이 제출하여야 합니다.

 

그렇습니다. 알츠하이머 치매 마우스들의 경우 제작에 사용된 유전자가 가족성 치매 환자에서 발현된 변이 유전자를 적용한 transgenic mouse이기에 사람에서 형성되는 동일한 amyloid-beta 단백이 형성되므로 사람 혈액에서 확립된 분석법과 동일한 표준물질과 질량분석 조건으로 측정이 가능했습니다.

           Amyloid-beta 단백은 응집(autoaggregation)을 잘하는 특징을 가지고 있습니다. 알츠하이머 치매 시 amyloid-beta 40과 42가 모두 증가하게 되는데 40에 비하여 42가

          다량체를 만들면서 훨씬 응집을 잘하므로 상대적으로 amyloid-beta 42는 응집되어 조직에 결합하게 되어 CSF와 혈액으로 유리되는 amyloid-beta 42의 양은 적습니다.

          따라서 절대량이 아니라 amyloid-beta 42/40 ratio가 알츠하이머 초기에 나타나는 지표로 사용되고 있습니다.

 

C57BL/6 기반의 5XFAD 마우스를 사용합니다. B6SJL 기반의 마우스는 6가지 손상들이 나타나는 시기가 2~6개월로 급속하게 진행되며 C57BL/6 5XFAD의 경우 2~12개월까지 상대적으로 느리게 진행됩니다. 병리학적 손상이 지나치게 빨리 나타날 경우 약물의 효과 있다고 하여도 이를 확인하기가 어려우므로 적절한 진행 속도를 가진 C57BL/6 기반의 5XFAD 마우스가 더 선호됩니다. 실제 5XFAD 마우스에서만 사람과 동일하게 amyloid plaques, neuronal loss, gliosis, synaptic loss, LTP/LTD changes, cognitive impairment가 모두 발현되므로 약물의 작용기전과 약효를 평가하는 데 가장 좋고 평가에 소요되는 시간도 짧다는 장점이 있습니다.

알츠하이머 치매는 neurodegenerative disease로 결국 모든 신경계에 대한 손상을 유발하게 되고 brain에서 기억(memory)에 관여하는 신경전달물질은 acetylcholine과 glutamate 로 알려져 있기에 알츠하이머 동물 모델 중 cognitive impairment가 나타나는 치매 동물 모델에서는 acetylcholine이 줄어들었을 가능성이 있고, 이 경우 cholinesterase activity도 줄어 있을 것으로 기대됩니다.

 

사람에서도 알츠하이머 환자에서 gender difference가 나타나는 이유는 아직 정확히 밝혀져 있지 않은데 저희 실험에서도 5XFAD mouse에서는 훨씬 신경 손상의 정도도 더 크게 나타나고 amyloid-beta 40과 42의 농도도 개체 간 차이가 너무 커서 부적절한 것으로 확인되었습니다.

감사합니다. 저희가 논문들을 검토하였을 때 5XFAD mouse를 약효 평가에 사용할 경우 3~6개월 사이가 가장 적절할 것이라 생각하고 이 실험을 진행하였는데 나중에 9개월과 12개월 마우스를 추가하여 보니 바이오마커로 혈액 중 amyloid-beta 42/40 ratio를 적용할 경우 현저한 통계적 유의성을 보이는 6~9사이가 가장 좋은 것으로 판단되었습니다.

 

예. 아밀로이드 단백은 매우 불안정하고 자가 응집을 잘하므로 다루기가 어렵습니다. 따라서 extraction이 핵심 기술입니다. 일정한 회수율을 구현하였고 밸리데이션 되었습니다.

 

인지기능 평가가 가장 기본적인고 중요한 지표이고 생물학적 시료 (혈액, 뇌척수액) 바이오마커와 영상 바이오마커 (MRI, amyloid PET scan)등이 필요에 따라 시행됩니다.

A-beta 42/40 ratio는 일차적으로 병의 진행 정도를 평가하는 prognostic biomarker는 아니고 병의 유무를 판단하는 diagnostic biomarker입니다. 물론 약물 치료 전에 비하여 치료 이후 A-beta 42/40 ratio가 증가된다면 (비교) 약효가 있는 것으로 평가되는 아주 좋은 지표 중 하나입니다.

Quanterex사와 Roche사 등 많은 회사에서 개발된 ELISA 법들도 감도가 아주 좋습니다. 다만 혈액 중 amyloid-beta 42의 농도는 너무 낮아 현재는 LC-MS/MS 법으로만 가능합니다.

현재 미국의 C2N Diagnostics 사가 가장 앞서 있어 미국 내 40개 주에서 상용화되어 있고 스페인의 Araclon Biotech, 그리고 뉴로비스입니다. 뉴로비스는 임상시험이 90건까지 진행되었기 때문에 임상이 추가되어야 합니다.

일반적으로 군당 8~10마리 정도 사용합니다. 알츠하이머에서 나타나는 인지기능 장애는 기억력뿐 아니라 뇌 손상 부위에 따라 공간, 후각, 정서 인지 장애 등 다양하게 나타나므로 행동학적 평가에서 유의성을 얻기가 매우 어렵습니다. 따라서 동물 숫자를 늘리는 것보다는 Morris water maze, radial arm maze, Barnes maze, fear conditioning test, novel object recognition test, passive avoidance test 등에서 몇 가지를 선정하여 여러 행동 실험을 진행하고 그중 유의한 결과가 나오는 data를 사용합니다.

5XFAD muse의 경우 1개월에 이미 망막 손상이 나타나므로 행동 평가에 가장 많이 사용되었던 Morris water maze 실험은 적절하지 않은 것으로 보고되었습니다.

임상시험에서의 primary endpoint는 행동 평가지표 (인지기능검사) 입니다.

 

임상에서는 유의성 있는 결과들이 보고되었는데, 저희는 아직 실험이 별로 실행되지 않아 상관성을 확인하지 못하였습니다. 추가 실험들을 통하여 확보하여야 하는 중요한 이슈입니다.

현재 확립된 방법은 0.1mL입니다. 0.05 mL에서 가능할 수 있도록 준비 중이며 이 경우 여러 번 분석 가능할 것으로 기대됩니다.

 

2개월에 이미 LTP/LDP의 변동이 나타나는 것으로 되어 있으므로 2~3개월령이 적당할 것으로 생각됩니다.

 

Sleep EEG power 분석을 하려면 headmounts나 telemetry 방식의 EEG/EMG system을 사용하셔야 합니다.

 

백색소음에도 장작 타는 소리, 바람 소리, 비 오는 소리, 파도 소리 등 아주 다양한 종류가 있는데 그 중 의뢰받은 종류의 소리입니다.

신경성장인자들이 신경의 유지에도 관여하고 있고 상호작용을 통하여 항상성(homeostasis)를 유지하고 있으므로 신경의 유지를 억제하거나 항상성에 큰 손상을 주는 정도의 효과를 주는 용량이 투여된다면 안전성에 문제가 발생할 수 있겠습니다.

일반적으로 마취한 상태에서 pilocarpine 과 같은 choline ester약물을 투여하고 채취하는 것으로 알고 있습니다.

비임상 결과와 임상 결과가 가장 잘 매칭되는 결과를 얻을 수 있지 않을까 기대됩니다. 비임상시험에서 적절한 치료법을 스크리닝하고 임상에서 기능성을 확정하는 가장 효율적인 방법이 될 것임을 확인하고자 하며 저희도 Piezo sleep monitoring 평가법 결과에 기반하여 9월에 임상시험 진행합니다. 이러한 결과들이 많이 확보되어야 상관성을 말씀드릴 수 있겠습니다. 아직은 데이터가 부족한 점이 있습니다.

수면무호흡증의 동물모델로 마땅한 것이 없는 것이 문제지만 적용할 만한 동물모델을 선정하여 주시면 실험은 당연히 가능합니다.

혈액이 아니고 침에서 분석할 경우 다른 침습적 방법이 동반되지 않는다면 IRB 심사 조건에 해당되지 않습니다. 규정상 IRB 면제 여부의 판단은 IRB에서 하게 되어 있으므로 처음 한 번만 심사를 받아 면제라는 판정을 받으면 그 다음부터는 그대로 진행 가능합니다.

           아직 밝혀져야 하는 부분이 많은 분야입니다. 가장 잘 알려져 있는 기전은 빛에 의한 neural circuit의 변동에 의한 melatonn 변동이 수면 조절에 관여한다는 것이기에

           일단 melatonin 의 변동성을 평가하여 보는 것이 시작이라고 생각하고 있습니다.

Tryotophan hydroxylase inhibitor로 serotonin과 melatonin의 합성을 억제하는 약물로 행동학적 변화로는 성적 행동이 증가되는 것으로 알려져 있습니다.

 

Amine계 물질로 열(heat), 빛(UV light), 알칼리성 상태에서 파괴되는 물리적 특성이 있습니다. 채취 즉시 냉동 보관하면 안정성에는 문제가 없으므로 채취 후 즉시 냉동 보관하도록 하여야 합니다.

아닙니다. 기회가 되면 적용하여 보고 싶습니다. 평가 메커니즘을 고려할 때 적절한 기면증 동물 모델이 있다면 더 정확한 평가가 가능할 것입니다.

대개 1차는 melatonin을, cortisol과 serotnin을 2차 바이오마커로 활용하고 있습니다.

아닙니다. 그렇게 진행은 가능하지만 지정하시는 분석 항목만 선정하여 분석 결과를 내어 드립니다. 항목에 비례하여 분석비가 결정됩니다.

그렇습니다. 행동 평가가 동시에 수행될 수 있고, 면역조직염색은 거의 함께 진행됩니다.

 

저는 피부와 근육에서 수행한 경험이 있습니다. 다른 장기들도 가능합니다.

            예. 저희의 현재 가장 중요한 비즈니스모델의 하나입니다. 추가로 문의 필요하시면 미팅이 가능합니다.

다양한 종류가 있고 0.2 mL 정도를 많이 쓰이는 것으로 압니다. 뇌 조직 안에는 혈관이 없으므로 시술 시 probe가 들어갈 부분이 완전히 지혈을 하고, 모든 혈관을 제거하고 건조시켜야 합니다. 조금이라도 혈액이 따라 들어가면 실험은 실패합니다. Probe가 위치하고 있는 부위가 타겟 조직의 extracellular space로 diffusion에 의하여 들어온 물질을 일정 시간 동안 수집하는 개념입니다.

 

대개 군당 8~10마리 사용합니다.

저는 피부와 근육에서 한 경험이 있습니다. 가능할 것 같습니다.

마취를 유지할 것인지 자유롭게 움직이는 상태에서 할지에 따라 결정됩니다.

 

마취 하에서 진행합니다. 원숭이의 경우 실험 시 느끼는 스트레스가 실험에 미치는 영향이 클 것이므로 마취로 진행하는 것이 더 적절한 것으로 판단됩니다. 비용은 저희도 다른 시설을 이용하여야 하기에 조건에 따라 달라집니다.

MRS도 metabolite를 분석하기는 하지만 정량적이라기 보단 정상 조직과 이상 조직을 비교하여 진단을 내리는 목적으로 사용하는 것으로 알고 있습니다. Mass는 정확한 농도 값을 분석 결정합니다.

 

예. 당연히 그렇습니다. 타겟 부위을 선택적으로 하기 위하여 특정 조직의 크기에 맞춘 probe를 사용하여 타겟 부취에서만 샘플링을 시행합니다.

           그렇습니다. Optogenetic을 같이 수행하기도 하고 microelectrde를 삽입할 수 있습니다.

타겟 질환이 신경정신질환이라면 반드시 어느 정도는 BBB를 투과하여야 합니다. (1~2%, 좋은 것이 4%, 최고로 높은 투과도 보인 약물이 7~9% 정도인 것으로 알고 있습니다)

           어떤 모델 동물이든 제대로 만들어진 모델이라면 상관없습니다. 미세투석은 설치류와 돼지 원숭이에서 시행하고 있습니다.

물론입니다. 출장 실험도 가능합니다.

없습니다. 흥미로운 기술이네요. 알려 주셔서 감사합니다.

말초조직에서는 말초신경도 마찬가지로 약물의 효과는 혈류에 의하여 어느 정도 농도에 폭로되는지가 결정되고 항체 약물이 그 조직에 가지고 있는 친화성, 약효의 potency 등에 의하여 종합적으로 결정될 터이니 실제 확인하여야만 하겠습니다.

아쉽게도 저희는 electrophysiology system은 구비하고 있지 않습니다.

가능합니다.

            자율신경계 타겟 약물은 타겟으로 하는 장기와 어떤 질환을 대상으로 하는지에 따라 실험방법이 결정되겠습니다.

 

 

참가하여주신 분들께서 많은 Q&A 질문을 남겨주셨고, 저희가 드렸던 답변이 방문해주신 선생님에게 조금이나마 도움이 되기를 바랍니다.

천천히 읽어 보신 후 추가적인 상담 및 견적이 필요하시다면 홈페이지의 견적의뢰를 통하여 접수를 부탁드립니다.

감사합니다.

오늘도 좋은 하루 보내세요